Patohistološka analiza i dalje predstavlja zlatni standard za postavljanje dijagnoze difuznog B-krupnoćelijskog limfoma (DBKL). Precizna karakterizacija genetskih oštećenja i subtipova unutar DBKL omogućava identifikaciju pacijenta sa agresivnijim i nepovoljnim tokom bolesti. Kod takvih bolesnika, često ponavljanje biopsija u cilju dinamičkog praćenja terapijskog odgovora, prognostičke procene, kontrole nakon lečenja ili detekcije ranog relapsa bolesti, nije primenjivo u kliničkoj praksi. Zbog toga je u poslednjih 5 godina porastao interes za „tečnim biopsijama“ zasnovanim na neivazivnim i jednostavnim određivanjem slobodno-cirkulišućih nukleinskih kiselina u plazmi obolelih od DBKL. Vanćelijske nukleinske kiseline mogu biti u vidu cirkulišuće DNK, delova informacione RNK (mikro RNK), egzozomalne RNK i poreklom su od apoptotičnih, viskoproliferativnih ili nekrotičnih ćelija. U bolesnika sa limfomima, najdalje su odmakla istraživanja slobodne DNK poreklom iz tumorskih ćelija - cirkulišuće tumorske DNK (ctDNK), koja čini oko 5% ukupne slobodne DNK.

Analiza ctDNK iz uzorka plazme bolesnika, počinje ekstrakcijom slobodne DNK i stvaranjem fragmenata DNK - tzv. referentne genske biblioteke. Dalja obrada fragmenta u DBKL se najčešće vrši neinvazivnim sekvencioniranjem tumorskog imunoglobulinskog gena sledeće generacije (IgNGS) ili metodom personalizovanog kancerskog profilisanja dubokim sekvencioniranjem (CAPP-Seq). Od pomenutih, CAPP-seq platforma je najsenzitivnija i sa najširim dijagnostički dijapazonom. Pored informacije o količini ctDNK, konačni rezultat detektuje prisutvo tumor-specifičnih genetskih alteracija u ispitivanom pacijentu.

Određivanje količine ctDNK metodom IgNGS, pre otpočinjanja terapije, omogućuje procenu stepena opterećenja tumorom, jer koreliše sa incijalnim IPI indeksom i nivoom LDH, dok je u drugoj studiji istom metodom pokazana korelacija sa ukupnim tumorskim volumenom merenim FDG-PET skenom.

Analiza genetskih oštećenja u ctDNK, CAPP-seq metodom, pre otpočinjanja lečenja, je uspešno identifikovala pacijente sa kraćim periodom bez bolesti (event free survival-EFS) i lošijim ukupnim preživljavanjem (overal survival-OS). Pri tome je prediktivna sposobnost ctDNK analize pre prve linije ali i pre salvage terapije, bila preciznija u odnosu na IPI skor, FDG-PET sken ili merenje ukupnog tumorskog volumena. U literaturi su opisana otkrića mutacija u ctDNK čak i u odsustvu detektabilnog limfoma. Molekularna karakterizacija, identifikovanjem ćelije porekla DBKL se poklapala u 90% sa nalazima iz tkivnih uzoraka, a sve translokacije (Bcl-2, Bcl-6 i Myc), identifikovane FISH metodom su nađene i u ctDNK uzorku.

Određivanje nivoa receptorskih genskih sekvenci u ctDNK, metodom IgNGS, nakon dva ciklusa terapije je omogućilo identifikaciju pacijenata sa dužim periodom do progresije bolesti. Sniženje ctDNK za 2 log posle prvog ciklusa terapije je definisano kao “rani molekularni odgovor“ a posle 2 ciklusa pad od 2,5 log  kao „veliki molekularni odgovor“. Ovi nalazi su sa većom preciznošću predvideli EFS i OS u bolesnika, od „interim“ PET skena ili IPI skora. Vrednost ctDNK za praćenje terapijskog odgovora se ogleda i u stvaranju „kontinuiranog individualizovanog indeksa rizika“ (continious individualized risk index-CIRI) u kome se kombinuju nalazi PET skena, IPI skor, ukupni metabolički volumen tumora, fenotip limfomske ćelije (prema ćeliskom poreklu) i nivoi ctDNK. Navedene analize su rađene pre terapije i posle drugog ciklusa. Preliminarni rezultati su pokazali superiornost CIRI skora u predviđanju 24 mesečnog ishoda terapije u odnosu na standardne prognostičke faktore.

Praćenje nivoa ctDNK nakon terapije je u jednoj studiji pokazalo sposobnost rane detekcije relapsa, prosečno 3,5 meseca pre vidljive pojave DBKL, a u drugoj prosečno 2 meseca pre prvih radioloških znakova. U tim okolnostima, izvesni autori su detektovali i nove mutacije ukazujući na evoluciju limfoma u relapsu.

Na osnovu svega, može se zaključiti da će određivanje ctDNK u praksi olakšati identifikaciju visokorizičnih pacijenata sa DBKL i pojednostaviti praćenje terapijskog odgovora. Praćenje ctDNK nakon lečenja će omogućiti detekciju minimalne rezidualne bolesti, otkrivanje ranog relapsa i biološke transformacije limfoma, što će imati snažan uticaj na donošenje terapijskih odluka u lečenju pacijenta sa DBKL.

Prof. dr Goran Marjanović,

Klinika za hematologiju, alergologiju i kliničku imunologiju

Univerzitetski Klinički Centar Niš

M-RS-00002154